primer5(在线设计引物) v5.0

primer5是一款由加拿大Premier公司推出的引物设计应用软件，可以方便专业的人员进行PCR、测序引物、杂交探针的设计操作，集合了分为序列编辑窗口（genetank）、引物设计窗口（primer design）、酶切分析窗口（restriction sites）和纹基分析窗口（motif）、引物设计窗口、序列编辑窗口等，可以方便用户快速得出引物分析的结果。此外，软件还可以针对模板dna的来源以相应的遗传密码规则转换dna 和氨基酸序列，它有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，已被引物设计行业人士认为是一款相当不错的软件。如果你也需要它的帮助，那就快来下载收藏吧。

软件功能介绍

1、软件的主要功能分四种，即引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。前三种为其主要功能。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列"朗读"、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。

2、还可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(Plant Mitochondrion)、原生动物线粒体(Protozoan Mitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mito-chondrion)和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion)。

软件使用帮助

一、限制性酶切点分析及基元查找功能

1、其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列，-35 序列等)，按确定即可

2、常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到,你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元

二、引物设计

1、打开DNA序列后点击按钮primer，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整

2、搜索目的(Seach For)有三种选项，PCR 引物(PCR Primers)、测序引物(Sequencing Primers)和杂交探针(Hybridization Probes)

3、搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer，或Both)，或者成对查找(Pairs)，或者分别以适合上、下游引物为主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外还可改变选择区域(Search Ranges)，引物长度(Primer Length)，选择方式(Search Mode)，参数选择(Search Parameters)等等

4、使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按search，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按OK，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序(Rating)排列，满分为100，即各指标基本都能达标

三、引物点击

1、点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，所得结果分三部分，

2、模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构(Hairpin)，二聚体(Dimer)，错误引发情况(False Priming)，及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer)

3、当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况

4、一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度

四、引物修饰编辑

1、在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列

2、若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可

3、对简并引物的分析不需像一般引物那样严格

4、总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件

primer5设计引物教程-primer5使用教程

获得基因序列后，打开primer 5.0

点击File-new-DNA sequence

粘贴cDNA序列-as is-ok

点primer

点search-调整如图参数（产物长度一般为100-300，引物长度一般为20左右，视情况调整）

点ok，弹出的新窗口也点Ok

弹出下图窗口后，先看右边，根据系统设计的引物进行筛选，优先评分较高的

注：S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再细看

①ΔG绝对值小于10

②tm在58左右，正负2度

③GC%在40%-60%

④末端不能是A

⑤不能有连续3个相同的碱基

⑥3’端一定不能有错配

【筛选原则】：

1、最好hairpin, dimer, false priming 没有

2、最好是没有连续相同碱基，如TTT、GGG

3、最好两个引物之间bp之差小于等于2，

4、产物长度大于100，小于300最好，也可以到400

5、tm在58左右，正负2度

6、一般设计时引物18-22长度，最长不要超过25

7、3’不能以A结尾

8、出现Found时，ΔG绝对值小于10

注：由于基因序列本身的差异，一般很难调到所有原则都满足，但是可以对系统给出的引物中的前几对进行调整，尽可能满足以上原则。

【如何调整】：

以系统给出的第一对引物为例（看框住的地方），虽然系统给出的评分比较高，但是下游引物可能出现发夹结构（Hairpin）和二聚体（Dimer），我们可以尝试调整一下。

首先点击左上角的A（Anti-sense），当图示的引物与A的颜色一直时，表示展示的是Anti-sense，然后把鼠标的光标放在引物的位置左右滑动，调整上下游引物位置。

下图是从3’往右移动了一个碱基，注意引物的长度会增加（只要是滑动了引物，改变了它的位置，长度就会增加，此时需要删除多余的碱基，到合适的长度）

点击Edit Primers，即可删除多余的碱基

弹出如下窗口后，光标点在①号位置，删除几个碱基后，

点击②号位置Analyze,点击③号位置ok

应该删除几个碱基？滑动之后多了5个碱基，一般是删除5个，但是下图我删除了6个，因为删除5个后末尾是A，我们在调整的时候可以多删，也可以少删，引物长度在合适范围即可

注意编辑引物时，只能从右边添加或删除碱基，如果想在左边添加或删除需要通过左右移动碱基的位置。有时候评分不错的上下游引物也可以调整，以下图为例，我想删掉5’端的一个C，降低GC含量

首先把光标放在引物的位置，将引物向后移动一个，看下图可以观察到引物向后移动了一个碱基，长度增加了，此时点击Edit Primers。

删除6个碱基后点击Analyze（分析）（删除几个碱基视情况而定）

最后的结果

5' CACTGACTGCCAGAAGACC 3'

5' TACTCGTTCCAGGACCACC 3'

【如何导出？先打开一个Excel文件】

点击Edit-copy-sense primer-粘贴

点击Edit-copy-Anti sense primer-粘贴

总结：根据系统给出的评分，看前几对引物是否是理想的引物，大部分情况不会都满足上述原则，需对前几对进行调整。（三步结合使用）

一：删除或添加末端碱基

二：拖动碱基的位置，向前移动一个或多个碱基或向后移动一个或多个碱基

三：点击Edit Primers，删除几个碱基后分析

终极大法：有时候调整了也达不到理想的效果，尝试耐着性子调整第一对，实在调不了，直接用第一对。

注：Win10系统使用时将输入法切换为英文，防止软件弹出。

软件特色

病理检测引物设计：可以用在高保区域设计引物

等位基因特效引物：设计专用于扩增某一类相关序列中特定成员的引物

种间交叉引物设计：利用来自多个物种的序列设计扩增引物